免疫組化實驗步驟

基本原理：免疫組化是利用抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細胞內抗原(多肽和蛋白質)，對其進行定位、定性及定量的研究。

1.1組織標本的處理

1）將組織塊大小約為（1×1×1cm）的組織樣本放入10%的中性福爾馬林溶液中，等固定48h后，將組織取出對組織面進行修整并放入包埋盒中

2）利用自動脫水機對包埋好的組織樣本進行脫水處理

3）取出已經脫水完的組織，將組織外圍的石蠟溶解，將脫蠟的組織塊以最大切面朝下放入鉛制模具中，加入石蠟將組織完全包埋，蓋上底板，置于冰上冷卻，放入-4℃冰箱

4）調整切片機，對石蠟包埋的組織進行修片

5）將切片厚度設置為3μm/片，進行切片，右手連續轉動操作桿待出現3-4個折疊蠟片后，用左手持毛筆，筆尖輕觸完整蠟片下沿，慢慢的向后引導和拉伸蠟片，并且右手同時進行連續切片，盡量協調左右手使得蠟片連續不中斷

6）直至所需蠟片長度后，用右手持鑷子輕輕夾到蠟片尾端，緩慢的將蠟片由遠端向近端平鋪于攤片機后，在連接處分段，進行攤片和撈片（攤片機溫度設置）

7）撈好的片子置于玻片架上，保存于4℃冰箱

1.2 免疫組織化學染色

1.2.1 脫蠟、水化（組織脫水的目的是通過酒精的媒介讓有機溶劑滲透入組織，再讓石蠟置換有機溶劑，從而使組織包埋在石蠟中。水化是組織切片經二甲苯脫蠟后，用酒精洗去二甲苯，所以必須從高濃度酒精開始，然后再利用酒精的媒介入水。）

1）將4℃保存的切片取出，轉移至金屬切片架中，放入70℃恒溫烤箱中，烤片90min（使蠟片水分蒸發和石蠟融化，好讓組織切片牢固貼在玻片上。）

2）烤片結束后，立即將切片放入二甲苯I脫蠟10min

3）轉移至二甲苯II脫蠟10min

4）過梯度酒精（100%-95%-80%）各5min

5）在裝有自來水的缸中洗三遍，每次洗完后換上新的自來水

6）在純水中洗滌，上下涮洗15次，每次洗滌完換水重復3次，洗滌完后轉移至3%H2O2中浸泡10min，再過3次純水（內源性過氧化物酶會與基質溶液（過氧化氫和顯色劑，例如DAB）發生反應，導致假陽性。在與HRP偶聯抗體一起孵育之前，先用過氧化氫預處理樣本可以顯著降低這種非特異性背景。有效降低內源性過氧化物酶導致的非特異性染色）背景性太強：原因一

1.2.2 抗原修復（組織固定液福爾馬林會引起組織蛋白內或蛋白之間的亞甲基發生橋連，導致許多抗原決定簇被封閉）

7）將切片放于裝有0.01M檸檬酸緩沖液（pH6.0±0.1）的高壓鍋中，進行高壓修復2.5min，然后轉移到冷水中冷卻（自然冷卻？？溫度劇降可能引起脫片，同時高溫中的抗原蛋白分子鏈脫離了其他的束縛或聯結，會慢慢地恢復原來的形態和構型）（修復時間過長可能會使染色背景加深，緩沖液的量必須保證所有切片都能浸泡到，用過的檸檬酸緩沖液不能反復使用。）

8）等待冷卻期間配PBS液1：1000（純水）

9）稀釋抗體（一抗）（背景性太強：原因二，一抗濃度過高，一抗與非靶向的抗原表位的非特異性結合，降低一抗濃度或者增加封閉液濃度）（目標蛋白的結合太弱：一抗上的抗原決定簇與細胞上靶抗原的親和力很弱，可能因為組織切片長期保存而使其蛋白降解或變性。）

10）過3次純水（上下涮洗15次），然后用PBS洗滌3次（每次5min)

1.2.3 孵育抗體

11）血清封閉：將切片放入準備好的于一抗具有相同種源的血清中，室溫封閉15-30min。封閉完后傾去封閉液

12）將稀釋好的一抗滴加在切片組織之上，將切片置于4℃過夜孵育一抗。孵育完后，回收一抗，然后用PBS沖洗，3min×5次

13）滴加生物素標記的二抗，室溫或37℃孵育30min至1h，PBS沖洗，3min×5次（背景性太強：原因三，二抗與細胞上類似的抗原表位具有強的親和力而非特異性結合，如果封閉血清跟二抗來自同一種屬，那么稍微增大血清濃度至2%以上。如果用BSA或脫脂奶粉封閉，那么就可用與二抗同一種屬的血清。）

14）DAB顯色5-10min，在顯微鏡下掌握染色程度

15）自來水充分沖洗10min

1.2.4 復染（目的是形成細胞輪廓，從而更好地對目標蛋白進行定位，蘇木素復染（胞核染料）細胞核內的染色質主要是去氧核糖核酸（DNA）,DNA的雙螺旋結構中，兩條鏈上的磷酸基向外，帶負電荷，呈酸性，很容易與帶正電荷的蘇木素精堿性染料以離子或氫鍵結合而被染色，蘇木精在堿性溶液中呈藍色，所以細胞核被染成藍色

16）蘇木素染色：蘇木素染液染15s，如果染色液用了多次在使用前必須除去染色液中的金色雜質

17）自來水洗片至水轉清

18）用1%鹽酸分化，一般處理3s左右，具體處理時間根據染色的深淺，處理完后置于顯微鏡下觀察細胞核染色的程度（蘇木素染色之后，用水洗去未結合在細胞上的染液，但是在細胞核中結合過多的染料和細胞漿中吸附的染料必須用分化液1%鹽酸酒精脫去，才能保證細胞核和細胞漿染色的分明）因酸能破壞蘇木素的醌型結構，使色素與組織解離，分化不可過度

19）用自來水沖洗4-5次

20）放入碳酸鋰（返藍液）中反藍處理2s（分化之后蘇木素在酸性條件下處于紅色離子狀態，在堿性條件下處于藍色離子狀態，而呈藍色，所以分化之后用水洗去酸而中止分化，再用弱堿性水使蘇木精染上的細胞核變呈藍色，稱藍化作用）

21）反藍后放回水中繼續洗15min。

1.2.5脫水，封片

22）置于85%酒精中5min，95%酒精中5min，100%酒精中5min

23）二甲苯兩缸各10min

24）于通風櫥中風干二甲苯

25）中性樹膠封片

*以上內容來自知乎